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当前位置 -> 新闻资讯
->real -time PCR整体体系的优化 |
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1、基本参变量的优化：
1）MgCl2的液体浓度：在PCR反响中，MgCl2的液体浓度对酶的活性是至关关紧的，不止这么，合宜的MgCl2的液体浓度还能在反响中获得较低的Cp(crossingpoint)值（指PCR达到指数扩增期时，萌生一定的荧光高于环境并为摄谱仪所辨别时的循环数），较高的荧光信号强度以及令人满意的曲线峰值。所以对其的液体浓度挑选应谨慎认真。普通来说，对以DNA或cDNA为模型板的PCR反响，应挑选2－5mM液体浓度的MgCl2，对以mRNA为模型板的RT－PCR而言，则应挑选的液体浓度为4－8mM。
2）模型板的液体浓度：假如研讨者是施行第一次实验，那末应挑选一系列稀释液体浓度的模型板来施行实验，以挑选出最为合宜的模型板液体浓度，假如条件艰难，也至少要挑选两个稀释度（高和中、低液体浓度）来施行实验。普通而言，使Cp位于15－30个循环比较合宜，若大于30则应运用较高的模型板液体浓度，假如Cp小于15则应挑选较低的模型板深度。对于Cp值确实认，经验上是SYBRGreenI探针的荧光信号比本底高2倍，杂交探针的荧光强度比本底高0.3倍。
2、运用SYBRGreenI标定DNA时的条件优化：
1）MgCl2的液体浓度：大部分数引物－模型板对其的要求是2－4mM。
2）模型板的液体浓度：初次实验要求做一系列的稀释液体浓度，如条件限止，至少完成两个稀释的度的标定。DNA在50ng-5pg之间挑选，质粒DNA在106复印数左右。
3）引物的液体浓度：引物的液体浓度是一个影响PCR反响的关键因素，若液体浓度太低，会以致反响不绝对，若引物非常多，则发生错配以及萌生非特别优异的产物的有可能性会大大增加。对于大部分数PCR反响，0.3uM是个合宜的液体浓度，若初次选用这个液体浓度不理想，可在0.1－1.0uM之间施行挑选，直到达到满足的最后结果。
4）退火温度：第一次实验设置的退火温度应比计算做出的Tm值小5℃，而后在1－2℃内施行挑选。普通的，退火温度要依据经验来确认，这个经验值往往会同计算获得的Tm值有一定的差距。
3、用SYBRGreenI施行一步法RT－PCR的条件优化：
1）MgCl2的液体浓度：不一样的靶分子选用不一样的液体浓度，一般是在4－8mM之间挑选。
2）模型板的液体浓度：RT－PCR实验既可以选用总RNA，又可以选用mRNA，其液体浓度应在1pg-1ug之间挑选。对于低模型板液体浓度，可以增加数量适宜的MS2或用alternativeRNA作为载体施行标定。
3）对照设置：每一引物都应设有阴性对照，阳性对照和污染对照。
4、杂交探针标定DNA
1）MgCl2的液体浓度：在2－4mM的基础上加0.5－1.0mM，不过不要超过2.0mM。
2）杂交探针的液体浓度：初次实验每个探针用0.2uM，假如信号强度达不到要求，可以增加至0.4uM。
3）对照设置：每一引物都要设阴性对照，每一探针都要设阴性对照。每每实验都要设阳性对照。
4）其他的条件同SYBRGreenI。
5、用杂交探针施行实时定量RT－PCR：
1）MgCl2的液体浓度：在4－8mM之间施行挑选。
2）杂交探针的液体浓度：初实验用0.2uM，假如荧光信号强度不充足，可以增加至0.4uM。
3）模型板液体浓度设置：优化的扩增须施行一系列稀释度的实验，在条件有艰难的事情状况下，至少要施行两个稀释度的标定。选用1pg-1ug的总RNA或是mRNA，如果是模型板的液体浓度过小（小于10ng/ul），则可参加MS2或alternativeRNA作为载体。
4）对照设置：每个引物都要设无模型板对照，阳性对照以及污染对照。
6、关于杂交探针的名声：
在运用杂交探针施行实验时，务必注意避免探针－引物二聚体的形成和其本身在反响过程中的延伸。引物－探针二聚体的形成，主要是由于探针可与引物的3’末端杂交，其形成往后，会以致此二聚体扩增，因此同目标基因竞争反响的原料，造成反响的速率减退。探针其本身能同目标基因相接合，且其解链温度高于引物，所以它有可能作为引物而导发延伸反响，为了避免发生这种现象，一般是将其3’末端绝对磷酸化，使之不可以延伸，若此磷酸化不绝对或是没有磷酸化，便会萌生目标基因的副产物，因此干扰实验最后结果。鉴于以上这两点，所以对付探针专心预设，并将其末端绝对磷酸化。
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